1.适用范围

本方法适用于出口食品的检验。

2.培养基和仪器

2.1.培养基

甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)；胰酪胨大豆多粘菌素肉汤；酚红葡萄糖肉汤；硝酸盐肉汤；营养琼脂；l-酪氨酸营养琼脂；溶菌酶营养肉汤；改良V-P培养基；动力培养基；胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)；Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液；亚硝酸盐试剂；V-P试剂；碱性复红染色液。

2.2.仪器吸管

容量1.0mL和10.0mL，具0.1mL刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培养装置；涡动搅拌器；L形玻璃棒；恒温培养箱：30℃及36±1℃

3.样品的保存和送检

待检样品应保持在6℃以下运送并尽可能不使其冷冻。送达实验室后，应保存于4 ℃并尽快进行检验。如在4d内不能进行检验，应将样品储存在－20℃，检验前再于室温下解冻。脱水食品可在常温下送检和储存。

4.样品的制备

4.1.操作

以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎。称取50g放于无菌均质杯中。

4.2.过程

加450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000～20000r/min均质2min。制成1∶10样品稀释液。取1∶10稀释液10.0mL加到含有90.0mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1∶100的稀释液。每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10－6。

5.检验步骤

5.1.平板计数法

取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上。用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面。每稀释度接种两个MYP琼脂平板。将平板置于30℃培养24h。选取具有15～150个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板，进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。蜡样芽孢杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环。如反应不典型，可继续培养24h再计数。计数后，从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面，于30℃培养24h，按第6章进行证实试验。

根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的菌落数，按比例计算出该皿内的蜡样芽孢杆菌菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以10，即得每克样品所含蜡样芽孢杆菌数并作出报告。例：将检样10－4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定，证实为蜡样芽孢杆菌的是4个，则1g样品中蜡样芽孢杆菌数为(25×4/5)×104×10＝2×106。

5.2.最近似值(MPN)法

适用于污染蜡样芽孢杆菌数不大于103个/g的食品。选用三管法MPN系列。取10－1、10－2、10－3三种稀释液，每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤，每管接种1mL。置于30℃培养48±2h。从长菌的试管取培养物划线接种到MYP琼脂平板上。置30℃培养24～48h。从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落，接种营养琼脂斜面，置30℃培养24h，供作证实试验。根据证实试验确定为蜡样芽孢杆菌的管数，由MPN表〔附录C(补充件)〕计算蜡样芽孢杆菌的MPN值/g，并作出报告。

6.证实试验

6.1.形态观察

取营养琼脂斜面培养物，作革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大。

6.2.生化学性状

葡萄糖发酵试验： 接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下35 ℃培养24h。培养基应由红色变为黄色(表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸)。

硝酸盐还原试验：接种于硝酸盐肉汤中，35℃培养24h。加硝酸盐试剂后应为阳性反应(红色)。

V-P试验：接种于改良V-P培养基中，35℃培养48h。加V-P试剂及肌酸数粒，静止1h，应为阳性反应(伊红色)。

L-酪氨酸分解试验：接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35 ℃培养48h，阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性时应继续培养72h再观察。

溶菌酶试验：用直径2mm接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，35 ℃培养24h。该菌在本培养基(含0.001%的溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应，应继续培养24h。

卵磷脂酶试验：接种于MYP琼脂平板上，35 ℃培养24h。阳性反应菌落周围应出现沉淀环(表示产生卵磷脂酶)。

6.3.蜡样芽孢杆菌与类似菌的鉴别试验

动力试验:用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中，30 ℃培养24h。有动力蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈扩散生长，而蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长，形成所谓的蜂巢状扩散。也可用悬滴法检查。蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌通常运动极为活泼，而炭疽杆菌则不运动。

根状生长试验：用接种环取培养物接种于营养琼脂平板上，30℃培养18～24h。蜡样芽孢杆菌群的多数菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。其中唯独蕈状芽孢杆菌则形成根状生长的特征。

溶血试验：取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上，30～32 ℃培养24h。蜡样芽孢杆菌落周围呈现β型完全溶血的溶血环。苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱的溶血现象，而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。

蛋白质结晶毒素试验：取经30 ℃培养24h并于室温放置2～3d的营养琼脂培养物少许于载玻片上，滴加蒸馏水混涂成薄膜。经自然干燥，微火固定后，于涂膜加甲醇半分钟后倾掉，再通过火焰干燥，于载片上滴满0.5%碱性复红液，放火焰上加热微见蒸气(勿使染液沸腾)后持续1.5min，移去火焰，使载片放置0.5min再倾去染液。用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检。观察有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。如发现游离芽孢形成的不丰富，应将培养物置室温2～3d再行检查。苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性，而蜡样芽孢杆菌群的其他菌种则为阴性。

7.结果解释及报告

符合蜡样芽孢杆菌群的特征，有活泼的动力，很强的溶血能力，不形成根状生长和不产生蛋白结晶毒素，可报告为蜡样芽孢杆菌。 对偶尔遇到的一些少数可疑菌株，可以根据需要进行其他试验。如青霉素酶、噬菌体试验等。